Responses of plants and rhizosphere microorganisms in constructed wetlands under sulfamethoxazole stress
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摘要:
为探究磺胺甲恶唑 (sulfamethoxazole，SMX) 胁迫下人工湿地植物与根际微生物的响应机制，对不同浓度SMX在5种植物与根际微生物联合修复中的去除效率进行表征；依据SMX的去除效率，对唐菖蒲和风车草的根系活力、活性氧与抗氧化系统进行研究，同步分析其根际微生物群落在SMX和温度胁迫下的响应特征。结果表明：5种人工湿地植物与根际微生物联合修复中，唐菖蒲、风车草对SMX的去除率较高，平均值分别为40.38%、44.70%。当SMX浓度超过30 mg/L时，与0 mg/L时相比较，唐菖蒲、风车草的根系活力受到抑制，分别下降了69.77%、67.26%；随着SMX浓度的升高，唐菖蒲和风车草的活性氧含量分别增加了69.08%、72.67%，抗氧化酶活性降低了19.32%、24.83%；与常温条件（20~25 ℃）相比，低温条件下（4~12 ℃）下唐菖蒲、风车草的活性氧含量分别增加了2.26%、1.98%，抗氧化酶活性降低了47.72%、44.42%。高通量测序技术对根际微生物群落的测定结果表明，高浓度SMX对植物根际微生物群落多样性与物种丰富度有抑制作用，利用PICRUSt功能预测软件对微生物群落功能预测发现，以氨基酸和碳水化合物代谢功能为主的微生物细菌相对丰度较高。
Abstract:In order to explore the response mechanism of plants and rhizosphere microorganisms in constructed wetlands under the stress of sulfamethoxazole (SMX), the removal efficiency of different concentrations of SMX in the combined remediation of five plants and rhizosphere microorganisms was characterized. According to the removal efficiency of SMX, the root activity, reactive oxygen species and antioxidant system of Gladiolus hybridus and Cyperus alternifolius were studied, and the response characteristics of their rhizosphere microbial community under SMX and temperature stress were analyzed simultaneously. The results showed that the removal rates of SMX by Gladiolus hybridus and Cyperus alternifolius were the highest in the five constructed wetland plants and rhizosphere microorganisms, with an average of 40.38% and 44.70%, respectively. When SMX concentration was higher than 30 mg/L, the root activity of Gladiolus hybridus and Cyperus alternifolius was inhibited, which was 69.77% and 67.26% lower than that of 0 mg/L, respectively. With the increase of SMX concentration, the reactive oxygen species (ROS) content of Gladiolus hybridus and Cyperus alternifolius increased by 69.08% and 72.67% compared with 0 mg/L, respectively, but the antioxidant enzyme activities decreased by 19.32% and 24.83%, respectively. Compared with normal temperature (20-25 ℃), the ROS content of Gladiolus hybridus and Cyperus alternifolius increased by 2.26% and 1.98%, and the antioxidant enzyme activity decreased by 47.72% and 44.42%, respectively, under low temperature (4-12 ℃). The measurement results of the rhizosphere microbial community by high-throughput sequencing technology showed that high concentrations of SMX inhibited the diversity and species richness of the plant rhizosphere microbial community. PICRUSt function prediction software was used to predict the microbial community function, and it was found that the relative abundance of microbes with amino acid and carbohydrate metabolism was higher.
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Keywords:
- plants /
- sulfamethoxazole /
- temperature /
- microbial community /
- function prediction
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磺胺类抗生素(sulfonamides，SAs)是我国生产、销售和使用量最大的抗生素之一，具有抗菌谱广、稳定性高、亲水性较强的特性，能干扰和抑制细菌的生长与繁殖[1-2]。磺胺类抗生素在自然水体表层水中检出浓度在ng/L~μg/L量级，在污泥、沉积物及土壤中检出浓度在μg/kg~mg/kg量级[3]。水环境中的SAs主要来源于畜禽养殖废水、生活污水和污水处理厂出水。阮悦斐等[4]在养殖水体沉积物中发现磺胺甲噻二唑、磺胺二甲氧嘧啶的检出率较高，浓度为1.5~30.1 μg/kg。Samaraweera等[5]对位于科伦坡和希卡杜瓦的2个市政污水处理厂连续7 d和24 h进出水样品中17种常见抗生素进行监测，发现所有出水样品中均可检测到磺胺甲恶唑(sulfamethoxazole，SMX)、甲氧苄氨嘧啶(trimethoprim)、诺氟沙星(norfloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)和环丙沙星(ciprofloxacin)，在污水处理过程中抗生素仅被部分去除。由于抗生素不断进入水环境，对水生动植物和人类健康构成极大威胁[6-7]。
人工湿地(constructed wetlands，CWs)常被用于去除水中常规污染物，同时作为二级污水处理系统对包括抗生素在内的新污染物可以起到良好的净化效果[8-10]。人工湿地内植物的吸收和富集与微生物的生物降解对污染物的去除起到重要作用。人工湿地植物作为湿地生物过程中的主体，是湿地生态系统的重要组成部分，在湿地运行中起着非常重要的作用[11]。Liang等[12]研究发现，水生植物芦苇、香蒲、香根草和美人蕉对人工湿地中的SMX去除率约为73%。杨月琴等[13]研究不同水生植物对布洛芬和罗红霉素的去除效果，发现美人蕉对布洛芬的去除率最高(69.74%)，花叶芦竹对罗红霉素的去除率最高(94.06%)。植物通过光合作用将氧气运输到植物根系，为微生物提供良好的生存环境，促进微生物对水体中污染物的降解。然而，人工湿地植物在处理含抗生素废水的过程中会受到抗生素的长期胁迫，由于抗生素浓度和植物本身的耐受程度不同，植物的响应机制也存在差异[7]。Liu等[14]研究了不同浓度盐酸环丙沙星、盐酸土霉素和磺胺甲嘧啶对芦苇的潜在影响，发现抗生素浓度大于10 g/L时对根活性和叶绿素有毒性作用，而浓度为0.1~10 g/L时对植物根系活力和叶片叶绿素有促进作用。Liu等[15]研究发现，模拟废水中红霉素浓度为0.06 mg/L时，羊角月牙藻(Pseudokirchneriella subcapitata)的生物量开始下降。此外，抗生素可能通过影响根际微生物群落的结构和功能间接影响植物发育。有研究表明，抗生素胁迫可以减少微生物多样性，抑制与硫和氮循环相关的功能细菌群[16]。Zhang等[17]研究发现，四环素浓度为1 μg/L时，可以显著改变序批式活性污泥反应器（SBR）中微生物群落结构，Shannon-Weiner指数和Simpson指数达到最大值。Button等[18]研究发现，SMX进入湿地系统后微生物群落优势菌群相对丰度减少，微生物活性受到了抑制。
目前针对高浓度抗生素胁迫下植物与根际微生物联合修复中植物理化指标及根际微生物群落的响应特征研究仍然不足。笔者以人工湿地中分布较广泛的5种挺水植物为研究对象，探究湿地典型挺水植物与根际微生物联合修复对不同浓度SMX的去除效果，选择根系较发达的唐菖蒲和风车草，对其根系活力、活性氧与抗氧化系统在不同浓度SMX胁迫以及温度变化下的响应差异进行评价和分析，同时探究根际微生物群落结构组成与功能的变化，以期为植物与根际微生物联合修复技术在水污染处理中的应用提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
供试水生植物唐菖蒲(A)、风车草(B)、灯心草(C)、水葱(D)和水芹(E)，购自江苏宿迁飞达花卉园艺公司。选取SMX为目标抗生素，其纯度为98%，购自上海百舜生物科技有限公司。Hoagland营养液为格林凯尔公司生产。
1.2 试验设计
用去离子水洗净植物根系，将植物根部表面附着的沉积物去除，用1/5 Hoagland营养液水培60 d至植物生长稳定。选取生理表型一致的植株作为试验对象，在营养液中加入0、1、10、30、50、100 mg/L不同浓度梯度的SMX进行处理，以0 mg/L为对照，不同处理中水生植物的种植密度为16株/m2，设置3个平行，每5 d更换1次营养液，运行周期为60 d。试验于2019年在山东农业大学园艺实验站进行，自然光照，培养温度为20~25 ℃，湿度为60%~80%。试验的前30 d，对不同浓度SMX在5种植物与根际微生物联合修复中的去除效果进行测定与分析。依据SMX的去除效果，对2组去除效果较好的植物，采集其叶片及根部进行植物活性氧、抗氧化系统的测定；并在人工模拟气候室中，调节温度分别为4、8、12、24 ℃，测定温度胁迫下2种植物活性氧、抗氧化系统的变化；对2种植物在0 mg/L（CK）、1 mg/L（S1）、50 mg/L（S50）营养液培养下的根际微生物进行采集，进行微生物群落多样性分析。
1.3 抗生素的测定
1.3.1 色谱条件
使用液相色谱串联质谱LC-30AD+LCMS-8060(Shimadzu，日本)测定抗生素浓度。色谱柱为InertSustainTM Bio-C18(2.1×100 mm，1.9 μm)，流动相A相为0.1%甲酸，B相为乙腈，流速为0.4 mL/min；柱温为40 ℃，进样量为2 μL，洗脱方式为梯度洗脱。梯度洗脱程序：0～1.0 min，90% A相，10% B相，流速0.40 mL/min；1.0～8.0 min，5% A相，95% B相，流速0.40 mL/min；8.0～10.0 min，5% A相，95% B相，流速0.40 mL/min；10.0～10.10 min，90% A相，10% B相，流速0.40 mL/min。
1.3.2 色谱条件
离子源为ESI，加热模块温度为400 ℃，雾化气流速为3.0 L/min；干燥气流速为10.0 L/min，加热气流速为10.0 L/min；扫描模式为多反应监测(multiple-reaction monitoring，MRM)，接口温度为300 ℃，驻留时间为17 ms；DL温度为250 ℃。
1.3.3 标准曲线与检测限
抗生素检测采用内标法定量，内标物质为磺胺甲恶唑-d4(SMX-d4)。各抗生素的标准曲线为f(x)=383 987x+589 143，相关系数(R2)为0.996 8。检出限为0.03 μg/L，定量限为0.10 μg/L，精密度为4.12%，回收率为96.33%。样品抗生素检出限与定量限按照信噪比3倍与10倍设定，分别进行了场地空白、方法空白和平行样试验，用于控制背景值影响及交叉影响。
1.4 根系活力与抗氧化系统指标测定
1.4.1 根系活力的测定
根系活力采用TTC法[19]测定。称取混合根系样品0.5 g 放入遮光处理的试管中，加入0.4% TTC溶液和磷酸缓冲液等量混合液10 mL，使根充分浸没，在37 ℃水浴锅中保温3 h后加入2 mL硫酸，对照为先加硫酸再加根系。将根取出，吸干水分后与3~4 mL乙酸乙酯一起磨碎，将红色提取液移入试管中，并将残渣洗涤干净，使最终体积为10 mL，在485 nm下比色。
1.4.2 抗氧化系统的测定
称取0.5 g新鲜叶片，加入2 mL磷酸缓冲液(0.05 mol/L，pH为7.8)，冰浴研磨，转移至离心管中，再以2 mL的缓冲液清洗研钵，4 ℃下10 000 r/min离心20 min后，取上清液冷藏保存。依据汤叶涛等[20]的研究方法测定丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)和超氧阴离子(O2−)浓度。超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)的活性测定与Liu等[21]的方法相同。
1.5 高通量测序
1.5.1 DNA提取
参考de Bulgarelli等[22]的方法，随机取植物根部(5 g)浸没于无菌PBS溶液中，180 r/min孵育10 min后取出，此过程重复3次，将3次洗涤液汇总后过0.22 μm滤膜，收集滤膜备测植物根部微生物菌群。备测滤膜置于−80 ℃超低温冰箱，避光保存。
1.5.2 微生物多样性检测与分析
根据E.Z.N.A.® soil DNA kit (Omega Bio-tek, Norcross, GA, 美国)说明书进行DNA 抽提，使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量，使用NanoDrop 2000 UV-vis spectrophotometer (Thermo Scientific, Wilmington，美国)测定DNA浓度和纯度。利用高通量测序技术对系统内的不同微生物聚集形态进行分析，引物由上海生工生物工程股份有限公司制备，PCR反应：预变性，95 ℃，3 min；变性，95 ℃，30 s；退火，56 ℃，30 s；延伸，72 ℃，40 s变性至延伸步骤，重复35次。序列F:TCCTACGGGAGGCAGCAGT；序列R:GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT。在97%的相似水平下对所有序列进行OTUs (operational taxonomic units)划分并与RDP (Ribosomal Database Project)数据库比对，基于此进行物种组成、Alpha多样性及群落结构分析。
1.6 数据统计分析
所有数据均采用Excel 2016软件进行预处理，并用Origin 2017软件进行绘图；采用Alpha多样性分析评价微生物群落的丰富度和多样性，利用PICRUSt功能预测软件进行微生物群落代谢功能预测。使用单因素方差法分析不同植物对相同浓度SMX的去除率以及同一植物在不同浓度SMX胁迫下生理指标间的差异性，其中当P<0.05时认为具有显著性差异。
2. 结果与讨论
2.1 5种人工湿地植物对SMX的去除效果
5种植物水培30 d后对不同初始浓度的SMX(1~100 mg/L )的去除率如图1所示。由图1可见，当SMX浓度为1和10 mg/L 时，对SMX去除率最高的是水芹(65.39%、52.97%)，其次是风车草(61.47%、48.56%)。SMX浓度为30~100 mg/L时，对SMX去除率最高的为风车草(35.87%~43.22%)，其次是唐菖蒲(27.45%~35.21%)。值得注意的是，水葱、水芹对SMX的去除率随着时间的推移而显著下降。SMX浓度较低时，抗生素对植物的胁迫作用较弱，此时植物根部通过主动吸收和物理吸附去除SMX，而高浓度SMX可能对这2种植物的根系产生较强影响。SMX的去除分为2个阶段：前期大量SMX被吸附于植物根部；随着抑制作用增强，根系活力受到影响，无法吸收根表富集的SMX，使得SMX从根部重新释放于水中。周品成等[23]研究发现，随着水培液中抗生素浓度的增加，高浓度(大于100 μg/L)的抗生素会抑制植物生长，使植株株高和叶绿素浓度显著小于对照处理；Liu等[14]发现较高浓度(大于10 μg/L)环丙沙星、土霉素和磺胺嘧啶对芦苇根活力及叶片叶绿素合成有抑制作用，而较低浓度(0.1~1.0 μg/L)抗生素则有促进作用。5种人工湿地植物中，唐菖蒲和风车草对1~100 mg/L的SMX的平均去除率分别为27.45%~45.32%和35.87%~61.48%。唐菖蒲为根茎型植物，耐污能力较强，而风车草为须根型植物，根系发达，能够更好地适应和耐受抗生素环境，生物代谢活性高，这可能是2种植物具有较强SMX去除性能的重要原因。研究表明，人工湿地植物对抗生素环境的耐受性很可能取决于其根系发达程度，根系越发达，分泌的根系分泌物就越多，从而更好地缓解抗生素的胁迫和改善周围的根际环境，降低外界环境毒性[22]。
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图 1 5种植物水培30 d后对不同初始浓度SMX的去除率注：字母相同表示在P=0.05时差异不显著，字母不同表示在P=0.05时差异显著。Figure 1. Removal rates of SMX with different initial concentrations of five plants after 30 days of hydroponic cultivation2.2 SMX胁迫下唐菖蒲和风车草生理指标变化
2.2.1 根系活力
根系活力大小可以反映根系代谢强度大小。由图2可见，SMX浓度为1和10 mg/L时，2种植物的根系活力均高于SMX浓度为0 mg/L时，说明植物根系对SMX胁迫有一定的抵抗能力，可通过提高代谢作用来缓解SMX对自身的伤害。鲍陈燕等[24]研究发现，在土霉素、恩诺沙星浓度为50~100 μg/L时，水芹根系活力并未受到抑制，反而进一步促进了水芹根系的生长。但张天莹等[25]研究发现，磺胺二甲基嘧啶浓度达到10 mg/L、环丙沙星浓度达到5 mg/L时，均能抑制小麦的根系活力，且随着抗生素浓度的升高小麦根系氧化还原力降低，根系活力逐渐减弱。本研究中，SMX浓度高于30 mg/L时，2种植物的根系活力显著下降(均低于SMX浓度为0 mg/L时)，且SMX浓度越大，根系活力受抑制程度越强，进而影响植物固氮能力，并且原生质形成和叶酸合成也会受到抑制，从而影响谷胱甘肽转移酶和一系列抗氧化系统酶的合成表达[26]。可见，抗生素浓度一旦超过临界浓度，就会抑制植物根系活力，影响根系养分的吸收。这与廖德润等[27]的研究结果类似，其研究表明，低浓度的抗生素对空心菜植株的生长具有刺激效应，而高浓度条件则表现出抑制效应。
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图 2 不同SMX浓度下唐菖蒲和风车草根系活力变化注：同图1。Figure 2. Changes of root activity of Gladiolus hybridus and Cyperus alternifolius in the presence of different initial concentrations of SMX2.2.2 活性氧与抗氧化系统指标
植物细胞在代谢过程中，会通过光还原反应、梅勒反应及光呼吸等过程产生一系列活性氧自由基(ROS)，如超氧阴离子（O2−）、过氧化氢（H2O2）、丙二醛（MDA）等[28]。ROS常被称为植物体内的毒副作物，当ROS积累到超过植物抗氧化清除能力的程度时，可造成膜脂过氧化及蛋白质、DNA损伤。MDA是膜脂过氧化作用的终产物，也是表征膜系统受害程度的重要指标。本研究中，唐菖蒲和风车草体内ROS、H2O2和MDA随SMX浓度上升而不断增加（图3）。当SMX浓度超过10 mg/L时，与0 mg/L相比，唐菖蒲和风车草体内MDA浓度最高增加1.66和1.45倍。Nie等[29]观察到究乳糖酸红霉素、盐酸环丙沙星和SMX胁迫下羊角月牙藻(Pseudokirchneriella subcapitata)发生脂质过氧化，MDA浓度显著增加。杨弯弯等[30]也观察到抗生素胁迫下铜绿微囊藻中MDA浓度增加的现象。
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图 3 不同浓度SMX对唐菖蒲和风车草的活性氧自由基含量和抗氧化酶活性的影响注：同图1。Figure 3. Effects of SMX at different concentrations on reactive oxygen species content and antioxidant enzyme activity of Gladiolus hybridus and Cyperus alternifolius植物体内抗氧化酶主要包括SOD、CAT、POD。SOD是超氧化物自由基清除剂，可将超氧化物催化转化为O2和H2O，在植物抵抗外界环境胁迫中起着非常重要的作用。当植物处于逆境时，CAT等保护酶能有效地清除过氧化物所产生的活性氧物质，防御植物细胞膜过氧化，降低植物受伤害的程度。POD是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，其活性大小反映了植物生长条件的好坏。由图3可知，与对照组相比，SMX浓度为1 mg/L时，CAT、POD、SOD活性均升高，说明植物在SMX存在时受到了氧化胁迫，诱导了抗氧化酶活性，以清除过多的ROS，使植物对环境的适应能力增强而有利于水体污染物的去除。这与陈友媛等[31]的研究结果一致。当SMX浓度为50和100 mg/L时，由于植物体内ROS大量产生并积累，抑制了抗氧化酶的活性，该SMX浓度已经超过植物自身抗氧化酶系统保护的范围，说明抗氧化酶系统保护是有限的。Riaz等[32]在试验中发现，氟喹诺酮类抗生素浓度为300 mg/L时，抗氧化酶系统无法保护小麦免受抗生素增加的胁迫。因此，在SMX胁迫下，会促进植物体内ROS的产生，抑制植物抗氧化酶系统。
2.3 温度胁迫下唐菖蒲和风车草生理指标变化
温度是影响植物生长发育最重要的非生物因素之一[33]，其不仅影响植物的生长，而且对植物体内的ROS含量、抗氧化酶系统产生明显影响。通过人工模拟气候室的温控系统进行调控，不同温度胁迫下唐菖蒲和风车草ROS含量及抗氧化酶活性变化如图4所示。由图4可知，随着温度降低，SOD、CAT、POD含量均减少。研究表明，低温胁迫下植物抗氧化防御系统会遭到破坏，酶活性下降[34]。但本研究发现，O2−和MDA含量随温度的降低而逐渐增加。这是由于植物体内的活性氧一般处于动态平衡，低温胁迫能引起植物体内活性氧含量增加，植物膜脂过氧化程度加大，导致植物MDA产生量增加[35]。李任任等[36]研究也发现，低温出苗下，甜菜幼苗叶片中MDA含量较高。因此，温度的变化在一定程度上刺激植物活性氧含量增加，抑制了植物抗氧化酶的活性。
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图 4 不同温度对唐菖蒲和风车草的活性氧自由基含量和抗氧化酶活性的影响注：同图1。Figure 4. Effects of different temperatures on the reactive oxygen species content and antioxidant enzyme activity of Gladiolus hybridus and Cyperus alternifolius2.4 微生物群落多样性分析
2.4.1 多样性与丰富度指数
采用α多样性指数(Shannon-Weiner指数、ACE指数、Chao指数、Simpson指数和样品覆盖率)评价唐菖蒲和风车草的物种丰富度和微生物群落多样性[37-38]，结果如表1所示。由表1可知，所有样本覆盖率均超过98%，说明序列分析可以覆盖几乎完整的细菌种群和相应数量的OTUs[39-40]。添加1 mg/L SMX时，唐菖蒲和风车草根际微生物Chao指数大于对照组，而在该浓度下根系活力也有所提高，说明添加1 mg/L 的SMX促进植物根系活力提升的同时也促进微生物物种丰富度增加。Xu等[41]研究表明，低剂量抗生素可刺激微生物群落活性，增加根际细菌群落的丰度和多样性。但添加50 mg/L 的SMX时，唐菖蒲和风车草根际微生物Chao指数小于添加1 mg/L的SMX。Xie等[40]的研究同样发现，Chao指数在MFC系统中随着SMX浓度增加而降低。
表 1 样品中微生物群落组成的丰富度指数Table 1. Richness index of microbial community composition in the sampleSMX浓
度/(mg/L)样本
编号Shannon-
Weiner指数Simpson
指数ACE
指数Chao
指数覆盖
率/%0 A_CK 4.26 0.03 501.61 464.90 98.76 B_CK 4.83 0.02 533.39 549.67 98.88 1 A_S1 3.81 0.08 481.53 534.28 98.71 B_S1 5.14 0.01 580.09 600.20 98.81 50 A_S50 2.98 0.16 601.12 489.07 98.59 B_S50 2.98 0.16 481.93 479.03 98.69 注：A_CK、A_S1、A_S50为唐菖蒲试验组；B_CK、B_S1、B_S50
为风车草试验组，下同。Shannon-Weiner指数常用于表征物种的多样性，同时反映物种的丰富度和均匀度[42]。添加1 mg/L的SMX后，唐菖蒲Shannon-Weiner指数从4.26降至3.81，风车草Shannon-Weiner指数从4.83增至5.14。在SMX浓度为50 mg/L 时，唐菖蒲和风车草根际微生物Shannon-Weiner指数相比于SMX为0和1 mg/L 时均显著降低。其原因可能是在SMX去除过程中起作用的微生物作为优势种保留下来，而其他微生物被消除，导致物种丰富度降低。同样的现象在污水处理厂中也被发现，如魏健等[43]研究发现，向污水处理厂的曝气生物滤池中逐渐通入抗生素废水，OTUs 从264降至220，微生物多样性指数从3.06降至3.01。类似的研究还表明，过度的抗生素污染会降低根际微生物的多样性[44]。
2.4.2 根际微生物群落结构与组成分析
在不同水平上检测微生物的相对丰度，以确定不同植物-微生物耦合体系处理SMX时微生物群落组成和结构的响应特征（图5）。
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图 5 不同水平上检测到的微生物的相对丰度Figure 5. Relative abundance of microorganisms detected at different levels在门水平上〔图5（a）〕，按相对丰度从大到小选择11个菌门（相对丰度均大于1%）进行分析。变形菌门（Proteobacteria）是各样品中的优势菌门（丰度为72.87%），其次是放线菌门(Actinobacteria，丰度为8.49%)和拟杆菌门(Bacteroidetes，丰度为6.08%)，说明SMX的引入增加了变形菌门、放线菌门、拟杆菌门的相对丰度，这3个优势菌门在处理含抗生素废水的人工湿地中分布广泛[45]。其中，变形菌门包括很多与碳、氮和硫循环中相关的细菌，拟杆菌门与有机物的降解密切相关[46-47]。唐菖蒲和风车草根际微生物群落组成在门水平上变化较明显，随着SMX浓度增加，变形菌门、厚壁菌门相对丰度有不同程度增加。先前有研究表明，变形菌门包括多种抗生素抗性细菌(ARB)，SMX的加入可以促进变形菌门在体外循环中的生长，并且变形菌有助于芳香族化合物的降解[48]。厚壁菌门可以产生芽孢，能够抵抗外部极端环境，并且厚壁菌门及其附属菌群能够分泌一种降解废水中有机污染物的细胞外酶，如纤维素、脂肪酶和蛋白酶等[42]。此外，系统内放线菌门、拟杆菌门相对丰度随SMX浓度升高而减小。因此，抗生素胁迫影响根际微生物对污染物和有机物的吸收、降解和功能代谢。
在属水平上〔图5（b）〕，按相对丰度从大到小选择20个菌属（相对丰度均大于1%）进行分析。优势菌属主要为unclassified_f_Burkholderiaceae (丰度为9.41%)、耐热单胞菌属 (Thermomonas，丰度为6.70%)、不粘柄菌属 (Asticcacaulis，丰度为6.19%)。SMX浓度为0 mg/L时唐菖蒲根际微生物主要优势菌属为耐热单胞菌属、柠檬酸杆菌属 (Citrobacter)，风车草根际微生物主要优势菌属为德沃斯氏菌属 (Devosia)、鞘氨醇菌属 (Sphingomonas)。添加1、50 mg/L SMX后，根际微生物群落的菌属丰度发生不同的变化。唐菖蒲中耐热单胞菌属、unclassified_f_Burkholderiaceae的丰度先降低后升高，说明伯克霍尔德氏菌属逐渐成为磺胺耐药菌；而柠檬酸杆菌属的丰度随着SMX浓度的增加而降低。unclassified_f_Burkholderiaceae作为变形菌门中具有代表性的菌科，其中大部分菌属具有发酵代谢作用。Qi等[49]在研究中也发现unclassified_f_Burkholderiaceae可能对SMX中的苯环降解起到关键作用。在风车草对照组中发现的优势菌属，在添加1和50 mg/L的SMX系统内发生了变化，罗河杆菌属(Rhodanobacter)、硫单胞菌属(Thiomonas)成为新的优势菌属。温慧洋[50]在研究中发现，A硫单胞菌属相对丰度的升高可能会导致SMX中S=O双键发生断裂，进而提高抗生素的去除效率。
2.5 微生物群落代谢功能预测
通过PICRUSt对抗生素胁迫下植物根际微生物群落level2水平代谢功能进行预测，结果如图6所示。由图6可知，当SMX浓度为1 mg/L时，唐菖蒲、风车草微生物代谢功能基因丰度大于SMX浓度为50 mg/L时。微生物细菌的生物降解和代谢功能基因随着SMX浓度升高而降低。Zhang等[51]研究发现，抗生素浓度会显著影响植物根系中参与无机离子、碳水化合物的转运及核苷酸和氨基酸的转化、代谢等功能基因的丰度。微生物群落代谢功能变化是复杂的，结合本研究结果可知，不同浓度的抗生素对于微生物群落代谢功能的影响不同，磺胺甲恶唑对微生物代谢功能变化的影响，是否有利于提高某些微生物的生存能力有待进一步研究。
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图 6 微生物群落代谢功能基因丰度注：右侧数值为丰度取对数后的结果。Figure 6. Metabolic gene abundance in microbial community3. 结论
（1）5种人工湿地植物中，唐菖蒲和风车草对1~100 mg/L SMX的去除率较高，平均去除率分别为27.45%~45.32%、35.87%~61.48%。二者根系发达，具有较强的耐污能力和较高的地上部分生物量，能够很好地适应和耐受抗生素环境，生物代谢活性高。
（2）在SMX胁迫下，当SMX浓度高于30 mg/L时，唐菖蒲和风车草的根系活力显著下降，且SMX浓度越大，根系活力受抑制程度越强。随着SMX浓度的升高，促进植物体内ROS的产生，抑制植物抗氧化酶系统。低温胁迫下，植物体内ROS含量逐渐升高，植物抗氧化酶活性逐渐降低，植物抗氧化酶系统受到抑制。
（3）唐菖蒲和风车草根际微生物群落组成在门水平上变化较明显，SMX浓度升高时，变形菌门、厚壁菌门成为优势菌门，二者可能对SMX降解起着重要作用；在属水平上，伯克霍尔德氏菌属和硫单胞菌属的富集可能对SMX的降解起到关键作用。对微生物群落代谢功能进行预测发现，不同浓度抗生素对微生物群落代谢功能的影响不同，SMX对微生物代谢功能变化的影响是否有利于提高某些微生物的生存能力，尚有待进一步研究。
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图 1 5种植物水培30 d后对不同初始浓度SMX的去除率
注：字母相同表示在P=0.05时差异不显著，字母不同表示在P=0.05时差异显著。
Figure 1. Removal rates of SMX with different initial concentrations of five plants after 30 days of hydroponic cultivation
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图 2 不同SMX浓度下唐菖蒲和风车草根系活力变化
注：同图1。
Figure 2. Changes of root activity of Gladiolus hybridus and Cyperus alternifolius in the presence of different initial concentrations of SMX
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图 3 不同浓度SMX对唐菖蒲和风车草的活性氧自由基含量和抗氧化酶活性的影响
注：同图1。
Figure 3. Effects of SMX at different concentrations on reactive oxygen species content and antioxidant enzyme activity of Gladiolus hybridus and Cyperus alternifolius
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图 4 不同温度对唐菖蒲和风车草的活性氧自由基含量和抗氧化酶活性的影响
注：同图1。
Figure 4. Effects of different temperatures on the reactive oxygen species content and antioxidant enzyme activity of Gladiolus hybridus and Cyperus alternifolius
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图 5 不同水平上检测到的微生物的相对丰度
Figure 5. Relative abundance of microorganisms detected at different levels
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图 6 微生物群落代谢功能基因丰度
注：右侧数值为丰度取对数后的结果。
Figure 6. Metabolic gene abundance in microbial community
表 1 样品中微生物群落组成的丰富度指数
Table 1 Richness index of microbial community composition in the sample
SMX浓
度/(mg/L)样本
编号Shannon-
Weiner指数Simpson
指数ACE
指数Chao
指数覆盖
率/%0 A_CK 4.26 0.03 501.61 464.90 98.76 B_CK 4.83 0.02 533.39 549.67 98.88 1 A_S1 3.81 0.08 481.53 534.28 98.71 B_S1 5.14 0.01 580.09 600.20 98.81 50 A_S50 2.98 0.16 601.12 489.07 98.59 B_S50 2.98 0.16 481.93 479.03 98.69 注：A_CK、A_S1、A_S50为唐菖蒲试验组；B_CK、B_S1、B_S50
为风车草试验组，下同。
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