Phytotoxic effects and environmental risk assessment of petunia hybrida irrigated with reclaimed water from the chip industry
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摘要:
芯片行业废水的再生利用对减少水环境污染、缓解水资源短缺、推动行业绿色发展具有重要意义。为明确芯片行业再生水灌溉对植物的毒理效应，采用矮牵牛作为模型生物，分析2种再生水灌溉期间其生长形态及对总蛋白、叶绿素、抗氧化系统和能量系统标志物的响应特征，基于第二代综合生物标志物响应指数（IBRv2）法评估再生水灌溉的环境风险。结果表明：2种再生水灌溉期间未对矮牵牛的生长形态产生明显不良影响；灌溉中期（9 d）矮牵牛总蛋白、叶绿素均被显著诱导，随后诱导作用减弱，抑制作用开始显现；灌溉中长期（9~15 d）矮牵牛的抗氧化标志物以抑制效应为主，但机体未出现明显的氧化损伤；灌溉期间矮牵牛能量系统标志物的响应规律无明显的一致性。芯片行业再生水灌溉矮牵牛的平均IBRv2为0.85~1.72，环境风险水平较低，但因再生水仍含有高浓度的氯离子和溶解性总固体（TDS），可选择敏感的生物标志物组合谷氨酸脱氢酶、丙酮酸激酶、丙二醛（MDA）或超氧化物歧化酶、MDA对环境风险进行监测和管控。建议进一步研发可有效降低芯片行业再生水中氯离子和TDS浓度的处理工艺，以保障芯片行业再生水回用于绿化灌溉的生态环境安全。
Abstract:Regeneration and utilization of wastewater in the chip industry is of great significance to reduce water pollution, alleviate water shortage and promote the green development of the chip industry. In order to clarify the phytotoxic effects of reclaimed water from the chip industry on plants, petunia hybrida was used as a model organism to analyze the response characteristics of growth morphology, total protein, chlorophyll, antioxidant system and energy system biomarkers, and to evaluate environmental risks based on the second-generation Integrated Biological Responses version 2 (IBRv2) during irrigation with two types of reclaimed water. The results showed that there was no obvious adverse effect on the growth and morphology of petunia hybrida irrigated with two kinds of reclaimed water. At the middle stage of irrigation (9 days), the total protein and chlorophyll of petunia hybrida were significantly induced, and then the induction was relieved and the inhibition began to appear. At the middle and late stage of irrigation (9-15 days), the antioxidant biomarkers of petunia hybrida were mainly inhibited, but no obvious oxidative damage to petunia hybrida occurred. The response patterns of energy system biomarkers were inconsistent during irrigation. The average values of IBRv2 for the two types of reclaimed water from chip industry were between 0.85 and 1.72, and the environmental risk level was low. However, because the reclaimed water still contained high concentrations of chloride ion and total dissolved solids (TDSs), the sensitive biomarker combination of glutamate dehydrogenase, pyruvate kinase, malondialdehyde (MDA) or superoxide dismutase, MDA could be selected to monitor and control the environmental risk. It was recommended to further research and develop the treatment process which could effectively reduce the concentration of chloride ion and TDS in the reclaimed water of chip industry, so as to ensure the ecological environment safety of the reclaimed water for green irrigation.
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Keywords:
- chip industry /
- reclaimed water irrigation /
- petunia hybrida /
- biomaker /
- phytotoxic effect /
- environmental risk
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半导体集成电路（简称“芯片”）是电子产品的核心器件，是我国各行各业实现智能化、数字化的基础，其产业技术的发展情况制约着一个国家的国民经济和社会发展，是一个国家现代化程度及综合国力的重要标志。目前我国已将芯片制造业作为战略性产业的重要领域之一大力扶持发展，这必然造成芯片行业废水的大量排放。芯片行业废水的深度处理及资源化利用对促进该行业的绿色发展，保障水环境安全具有重要意义。另一方面，在全球水资源日趋紧张和水污染加剧的情况下，工业废水的资源化利用是治污减排、开源节流、改善生态环境、解决城市缺水问题的有效途径之一[1-2]。工业废水经深度处理得到的再生水用途十分广泛，可作为城市中可重复利用的重要非饮用水，能够应用于农业灌溉、城市杂用水、景观用水及工业用水等非饮用领域[3-4]。
随着社会发展和生活水平的提高，城市绿地面积不断增加，导致城市绿化灌溉需水量的增加。国内外已有较多将再生水进行城市绿地灌溉的大面积应用，相关研究表明，绿地使用再生水与农作物、其他饲料作物不同，不会将有害寄生虫、原虫、病毒、细菌等污染物间接地作用于人类[5]，故对城市绿地灌溉所使用的再生水水质要求不严。虽然将再生水用于绿化灌溉是切实可行的，但由于不同地区再生水来源和处理程度上的差异、水质变异性、绿植种植情况和灌溉条件等因素[6]，都可能导致绿化灌溉的效果存在差异性。尤其是再生水中存在营养元素、盐分、各种离子等，可能会给生态环境带来风险[7-11]。一部分研究发现，再生水中含有的大量营养元素，可以促进植物生长[7-8]；然而另一部分研究表明，再生水灌溉植物也会产生一些负面影响，如再生水中过高的氮、磷养分也会降低土壤质量，阻碍作物正常生长，过多盐分容易导致叶片枯萎甚至焦枯，离子含量过高导致草坪草生长高度低，碳酸氢根离子过量不利于植物组织中叶绿体发展和蛋白质合成等[9-11]。目前再生水灌溉的研究对象主要集中于草坪、景观绿植，对观赏花卉的研究较少，且再生水水源多来自处理后的城市污水，因此需要加强再生水绿化灌溉尤其是污染物含量高、成分复杂的工业废水经深度处理回用于绿化观赏花卉的研究，以确保再生水灌溉的环境安全性。
笔者针对芯片行业废水经深度处理达到GB 3838—2002《地表水环境质量标准》Ⅲ类标准的再生水灌溉的环境风险问题，利用观赏花卉矮牵牛作为模型生物，明确再生水灌溉对矮牵牛的植物毒理效应，评估芯片行业再生水灌溉的环境风险水平，提出再生水回用过程中的生物监测方法，以期为保障芯片行业再生水灌溉的安全性提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 再生水水源及水质特征
灌溉试验组的2种再生水分别来自某芯片制造企业生产废水深度处理工程一期、二期出水，对照组灌溉采用自来水。芯片废水深度处理工程一期和二期的来水包括含氟废水、综合废水，含氟废水采用氯化钙混凝沉淀法进行处理，处理后的上清液进入综合废水处理系统；综合废水和预处理的含氟废水经过生化处理、混凝沉淀、人工湿地系统的深度处理后，出水（即再生水）主要指标达到GB 3838—2002的Ⅲ类标准（其中总氮按GB 18918—2002《城镇污水处理厂污染物排放标准》一级A标准管控），目前主要回用于景观河道补水或厂内绿化灌溉[6]。芯片废水深度处理工程一期、二期出水分别命名为再生水RW1、RW2，对照自来水命名为TW。
对照GB/T 25499—2010《城市污水再生利用 绿地灌溉水质》，2种再生水水质的基本控制项目pH、五日生化需氧量（BOD5）、阴离子表面活性剂（LAS）、氨氮及粪大肠菌群等均符合国标规定限值，而氯离子和溶解性总固体（TDS）是再生水中的高风险因子（表1）。再生水水质的选择控制项目，如铁、锰、铜、镍等重金属离子的检出浓度较低，镉、铬、铅、锌等重金属离子未检出，钠吸收率（SAR）、氟化物、有机物等低于GB/T 25499—2010规定限值，均满足再生利用于绿地灌溉的水质要求。
表 1 再生水的主要风险因子Table 1. Major risk factors of reclaimed watermg/L 编号 溶解性总固体
（TDS）浓度氯离子浓度 RW1 6680 2 041 RW2 5920 3 051 GB/T 25499—2010限值 ≤1 000 ≤250 1.2 供试植物的选择和培养
矮牵牛的品种繁多、花色丰富且环境适应能力强，具有“世界花坛花卉之王”的赞誉，在城市道路及公园中普遍应用，成为全球最普及且销售量最大的绿化观赏植物之一[12]。同时矮牵牛具有较短的生活周期与清晰的遗传背景，常用作污染物的监测和土壤修复试验生物。本试验所用矮牵牛、土壤均同批次购自上海典彤园艺有限公司，将矮牵牛栽种于体积为50 cm×18.8 cm×15 cm的花箱中，置于室外大棚中培养，每3 d浇水一次，每株植物浇水量为300 mL，大约1周时间花的生长状况趋于稳定后开展相关试验。
1.3 试验设计和处理
在简易花箱中培养牵牛花，每个花箱随机种植3株生长状态相同的矮牵牛，将花箱随机分为3组，分别采用再生水RW1、RW2和对照用自来水TW进行灌溉试验，每组设置3个平行试验。灌溉周期为3 d，采用滴灌的方式，每株植株的灌溉量为300 mL，置于室外大棚内自然光照条件下进行培养，并于第2、9、15天收集样品进行各种生物标志物指标的检测。同时每天观察矮牵牛的开花、叶片等生长情况，是否有死亡个体并拍照记录。
1.4 测量指标及方法
选取生物毒理学研究常被关注的12种生理生化指标作为生物标志物，包括总蛋白（TP）、叶绿素（Chl）、抗氧化系统的5种指标及能量代谢系统的5种指标，来揭示供试植物的生物标志物对再生水的响应机制及安全评价潜力。总蛋白是反映生物体生理活动的重要指标，也是对其他生理指标活性进行定量的先决条件。叶绿素是植物进行光合作用的重要色素。生物的抗氧化系统和能量代谢系统都是机体受到外界刺激后的重要响应系统，抗氧化系统是机体自我保护机制，能量代谢系统对维持生物体正常的生命活动起着重要作用。抗氧化系统的5种指标为超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、丙二醛（MDA）和总抗氧化能力（T-AOC），能量代谢系统的5种指标为三磷酸腺苷酶（ATPase）、谷氨酸脱氢酶（GDH）、谷胱甘肽还原酶（GR）、丙酮酸激酶（PK）和三磷酸甘油酸激酶（PGK）。
将供试植物矮牵牛每株植物的中部以下相同位置的叶面积接近的叶片进行称重并剪碎，混合均匀后快速分装并置于冻存管中，于−80 ℃冰箱中保存。本试验未选取中部以上部分，因为上部新长出的幼嫩小叶，相对于中下部叶片具有不同的代谢特征[13-14]。采用Mlbio海联生物公司的试剂盒测定样本的总蛋白、抗氧化和能量代谢系统的11种生理指标。植物样品中加入磷酸缓冲液，用试剂盒配套的裂解液在生物样品均质机中磨成10%的组织匀浆，离心（12 000 r/min，10 min，4 ℃）分离上清液，严格按照酶联免疫试剂盒说明书进行操作。叶绿素含量采用TYS-N仪器测定。
1.5 数据统计和分析
通过矮牵牛的植物毒理学试验，获得了再生水灌溉矮牵牛试验的第2、9和15天的总蛋白、叶绿素、抗氧化系统的5种指标及能量代谢系统的5种指标的变化数据。使用基于Beliaeff和Buregeot提出、由Guerlet等修改后的第二代综合生物标志物响应指数（IBRv2）法[15]进行环境风险评价，计算步骤如下：
（1）数据标准化：对于每种生物指标，计算某一采样日全部暴露组的平均值（X），并计算全部采样日的均值（m）和标准偏差（s）。X经过标准化后获得Y：
$$ Y = {{(X - m)} \mathord{\left/ {\vphantom {{(X - m)} s}} \right. } s} $$ (1) （2）每个时间点该生物标志物的得分（Ai）的计算公式如下：
$$ {A_i} = Z + \left| {{{X_{{\mathrm{min}}}}}} \right| $$ (2) （3）若式（2）中该标志物的活性因胁迫而被激活，则令Z=Y，反之令Z=−Y。IBRv2的计算公式如下：
$$ {\text{IBRv2}} = \sum\limits_{i = 1}^n {\left| {{{A_i}}} \right|} $$ (3) 式中：|Xmin|为所有时间段中该标志物均一化数据最小值的绝对值；n为生物标志物指标的总数。
1.6 数据处理
试验数据以平均值±标准偏差（X±s）表示，运用SPSS 24.0软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），并用Duncan's检验法进行多重比较，差异显著性水平为0.05。生物标志物的柱状图和IBRv2星状图绘制使用软件Origin 2021Pro；生物标志物的相关性分析及差异显著分析使用R语言及Rstudio软件，使用R包"GGally"进行相关性分析。
2. 结果与分析
2.1 矮牵牛的生长和形态
如图1所示，经深度处理的2种芯片行业再生水灌溉20 d后，矮牵牛植株长势正常。与对照组TW相比，再生水RW1、RW2灌溉下矮牵牛生长情况、叶片状态和开花均无明显异常，说明在试验期间，再生水对矮牵牛的生长、开花未产生明显影响。
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图 1 灌溉20 d后矮牵牛的生长形态Figure 1. Growth and morphology of petunia hybrida after 20 days of irrigation2.2 矮牵牛总蛋白的响应
矮牵牛总蛋白含量对再生水的响应结果显示（图2），再生水灌溉期间均对矮牵牛总蛋白含量产生显著影响（P<0.05）。随着再生水灌溉时间的延长，总蛋白含量呈先增长后减少的趋势，在第9天时总蛋白含量最高，在第15天时总蛋白含量最低。与对照组相比，再生水RW1灌溉下矮牵牛的总蛋白含量均显著高于对照组，在第2、9和15天时分别增加7.4%、21.3%和20.9%；再生水RW2灌溉下矮牵牛的总蛋白含量在第2和15天时低于对照组，分别减少3.0%和7.4%，而在第9天时高于对照组，增加了6.6%。再生水RW1对矮牵牛总蛋白表现出显著的诱导作用，再生水RW2对矮牵牛总蛋白有显著的短期（第2天）抑制、中期（第9天）诱导、长期（第15天）抑制效应。再生水RW1和RW2灌溉中期（第9天）时，矮牵牛的总蛋白含量呈同步高于对照组的规律。
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图 2 再生水灌溉对矮牵牛总蛋白含量的影响注: *表示差异显著水平为P<0.05, **表示差异显著水平为P<0.01，***表示差异显著水平为P<0.001。全文同。Figure 2. Effects of reclaimed water irrigation on the total protein content of petunia hybrida本研究的2种再生水TDS和氯离子含量较高，具有高盐度的特点，一般盐分过多对植物蛋白质代谢影响比较明显，会抑制合成，促进水解，从而使植物蛋白质含量降低[16]。但植物的耐盐性是受多基因控制的[16-17]，1983年Singh等[18]发现NaCl诱导烟草悬浮培养细胞产生盐胁迫蛋白。盐胁迫蛋白是指植物在受到盐胁迫时新合成的或合成增强的蛋白质，某些盐胁迫蛋白可能增强植物的抗逆性。盐胁迫下一些蛋白质合成受阻，而另一些蛋白质合成不受影响，还可能同时新产生盐胁迫蛋白以增强植物的抗逆性，至今已在数十种农作物中发现存在盐胁迫蛋白[19-21]。相关研究表明，盐可调节蛋白质的含量，盆栽无花果、坪山柚和福橘经NaCl处理后，叶片可溶性蛋白质含量明显增加[19,22]。矮牵牛对0.4%的氯化钠具有耐受性[23]，在受到一定程度的盐胁迫时，叶片中可能产生盐胁迫蛋白以抵抗不良环境影响，因此灌溉第9天时总蛋白含量均高于对照组；随着灌溉时间的延长盐分不断积累，可能是由于细胞中被抑制合成的蛋白质增多，或部分蛋白质的水解开始占主导[16]，在第15天时再生水对矮牵牛总蛋白的诱导作用减弱，再生水RW2对总蛋白含量先开始呈现抑制作用，总蛋白含量显著低于对照组。
2.3 矮牵牛叶绿素的响应
叶绿素含量的高低直接影响着植物光合作用的光能利用效率，是重要的生理指标之一[24]。再生水灌溉下，矮牵牛叶绿素含量变化如图3所示。随着灌溉时间的延长，叶绿素含量呈递增趋势，均在第15天达到各组最大值。灌溉初期（第2天），可能由于试验时间较短，2种再生水灌溉下的叶绿素含量相比对照组有变化，但均未表现出明显的差异性（P>0.05）；灌溉中期（第9天），2种再生水灌溉的矮牵牛叶绿素被显著诱导（P<0.05），其含量与对照组相比分别增加11.4%和17.1%，诱导强度最大；灌溉后期（第15天），再生水RW1的矮牵牛叶绿素含量略低于对照组，但未呈现显著的差异性（P>0.05），而再生水RW2的矮牵牛叶绿素含量仍保持显著的诱导效应（P<0.05），但相比中期诱导作用减弱。总之，再生水RW1对矮牵牛叶绿素有中期诱导效应，长期未见明显影响。再生水RW2对矮牵牛叶绿素有中长期诱导作用。可见，再生水灌溉15 d后，未对矮牵牛的叶绿素造成明显不良的影响，与对照组相比其生长情况、叶片均无明显异常（图1）。
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图 3 再生水灌溉对矮牵牛叶绿素的影响Figure 3. Effects of reclaimed water irrigation on chlorophyll of petunia hybrida对再生水水质的分析发现，再生水RW1和RW2中均含有N、P、Mg等叶绿素合成所需的营养元素，随着灌溉时间的延长，在第9天时再生水灌溉的矮牵牛的叶绿素含量均明显高于对照组，这与一些研究结果[25-26]一致。但再生水RW1和RW2中也存在Fe、Mn、Cu、Ni等重金属，且TDS、氯离子含量均显著高于GB/T 25499—2010《城市污水再生利用 绿地灌溉水质》中的限值，具有高盐度的特性。再生水中盐度会影响土壤的渗透性，导致土壤结构变化甚至板结；高盐度的灌溉水与植物根茎内部相比具有较高的渗透压，使植物的水分在压力的作用下渗透出来，造成植物相对缺水，出现叶片干枯、萎蔫等缺水现象[27]。一般植物对盐度都很敏感，且随灌溉时间的积累，每灌溉一次盐分积累一次，对植物产生持久性伤害。相关研究表明，随着再生水TDS浓度的增加叶绿素含量降低[27]，本研究RW1的TDS明显高于再生水RW2，可推测随着灌溉时间的延长，盐分逐渐积累，导致再生水RW1灌溉矮牵牛的叶绿素含量在第15天时就呈现出略低于对照组的趋势。同时因为矮牵牛也具备一定的耐盐性[23,28]，且水质分析发现再生水RW2中含有的N元素（TN浓度为12.3 mg/L）明显多于再生水RW1（0.44 mg/L），尤其是硝态氮，硝态氮可明显增加植株的叶绿素含量[29]，所以再生水RW2灌溉矮牵牛的叶绿素含量在第15天时仍显著高于对照组。
2.4 矮牵牛抗氧化系统的响应
植物在恶劣环境下，会产生大量的活性氧（ROS），ROS是植物代谢过程中的毒副产品如O2−、H2O2[30]。抗氧化酶作为抗氧化系统的重要组成，可清除植物体内因环境胁迫产生的活性氧自由基，也可灵敏反映植物对氧化胁迫的响应幅度，因而可用于评价污染物对植物的毒理效应[30-31]。超氧化物歧化酶（SOD）是植物抗氧化系统的第一道防线，能清除${\mathrm{O}}_2^- $的危害[32]。再生水灌溉下矮牵牛SOD活性的变化规律〔图4（a）〕表明，再生水RW1灌溉的第2、9天，矮牵牛SOD活性低于对照组，呈现出极显著的抑制效应（P<0.001），在第15天时SOD活性恢复至与对照组同等水平，未表现出显著的差异性（P>0.05）。再生水RW2灌溉下，矮牵牛的SOD活性与对照组比较均呈现出极显著性差异的现象（P<0.001），在第2天表现为极显著的诱导效应，在第9、15天表现为极显著的抑制效应。
过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）普遍存在于植物组织中，二者往往共同作用清除机体中的H2O2。矮牵牛CAT活性的变化规律〔图4（b）〕表明，2种再生水对矮牵牛CAT活性均具有显著影响（P<0.01）。再生水RW1灌溉的矮牵牛CAT活性在第2天显著高于对照组，第9、15天与对照组相比显著降低。再生水RW2灌溉的矮牵牛CAT活性在第2天显著高于对照组，在第9天显著低于对照组，在第15天又显著高于对照组。矮牵牛GSH-PX活性变化结果〔图4（c）〕显示，2种再生水对矮牵牛GSH-PX活性均具有极显著影响（P<0.001）。再生水RW1灌溉下GSH-PX活性都显著低于对照组，再生水RW2灌溉下的第2天GSH-PX活性显著高于对照组，第9、15天的GSH-PX活性与对照组相比显著降低。
各种抗氧化酶抵御氧化损伤的方式不同，对环境污染所造成的各种氧化胁迫也表现出显著不同的敏感性。再生水RW1灌溉的短时间内（第2天），矮牵牛SOD、CAT和GSH-PX中仅CAT活性被激活显著高于对照组，而再生水RW2灌溉的短时间内，矮牵牛SOD、CAT和GSH-PX活性同时被激活显著高于对照组，这可能与再生水RW1的全盐度（TDS浓度）高于再生水RW2有关。相关研究表明，在一定盐度范围内，植物的SOD、CAT活性被激活，以有效清除活性氧对细胞膜的伤害，保护细胞膜的结构与功能，增强植物的抗逆性，但超过一定限度后活性又下降至比对照组小[23,27,33]。随着灌溉时间的延长，再生水中污染物包括盐度积累使胁迫强度增强，3种抗氧化酶的活性低于对照组，显示以被抑制为主。
植物在正常环境下其体内的丙二醛（MDA）处于平衡的状态，但当过量的活性氧不能被有效清除而不断积累会导致产生细胞膜脂质过氧化反应，作为膜脂过氧化产物的MDA含量增加，植物受到的伤害程度加重[34-35]。再生水灌溉下矮牵牛MDA含量变化结果〔图4（d）〕显示，2种再生水的中长期灌溉均对矮牵牛MDA产生极显著的影响（P<0.001）。再生水RW1和RW2灌溉引起的MDA含量变化规律在第9、15天同步低于对照组，第2天RW1试验组的MDA含量明显低于对照组（P<0.001），而RW2试验组的MDA含量与对照组相比无显著变化（P>0.05）。2种再生水灌溉期间，矮牵牛的MDA含量均未超过对照组，未出现明显的细胞膜脂质过氧化反应。
植物机体对氧化胁迫的响应是各种抗氧化酶及其他抗氧化系统共同作用的结果，一个体系内的各种抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶的总的水平即体现了该体系内的总抗氧化能力。再生水灌溉期间，矮牵牛总抗氧化能力（T-AOC）的变化趋势如图4（e）所示，2种再生水均对矮牵牛T-AOC具有显著的影响（P<0.01）。再生水RW1灌溉下矮牵牛的T-AOC显著低于对照组；再生水RW2灌溉下矮牵牛的T-AOC在第2、15天时显著高于对照组，第9天时显著低于对照组；再生水RW1灌溉下的矮牵牛T-AOC低于再生水RW2。
综上，2种再生水灌溉对矮牵牛抗氧化标志物的影响表现为短期内（2 d）的响应机制有所不同，中长期（9~15 d）则以抑制效应为主；再生水RW1对矮牵牛的氧化应激程度的影响大于再生水RW2。
2.5 矮牵牛能量系统的响应
生物的生命活动与能量利用息息相关，能量代谢系统是机体受到外界刺激后的重要响应系统，对维持生物体正常的生命活动起着重要作用。再生水灌溉引起矮牵牛能量代谢水平发生相应的变化。三磷酸腺苷酶（ATPase）是生物体内一类重要的膜结合酶，与植物体内的能量代谢相偶联，因此与植物营养元素的吸收运输、生长发育、抗逆性都有密切的关系。外界环境的变化对植物体ATPase的活性会产生各种不同的影响[36]。再生水灌溉下矮牵牛ATPase活性的变化结果〔图5（a）〕显示，短期内（2 d）再生水RW1和RW2引起ATPase活性同步上调高于对照组，表现为极显著的诱导效应（P<0.001）；随着灌溉时间的延长，在第15天ATPase活性同步低于对照组，表现为极显著的抑制效应（P<0.001）。
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图 5 矮牵牛能量代谢生物标志物的响应Figure 5. Response of energy metabolism biomarkers in petunia hybrida谷氨酸脱氢酶（GDH）是细胞内机能代谢活性的关键酶，可以参与植物的调节和抗病毒活性，有助于提高植物的抗逆、抗衰老和耐受胁迫。再生水灌溉下矮牵牛的GDH活性变化结果〔图5（b）〕显示，再生水对矮牵牛GDH活性具有极显著的影响（P<0.001）。短期内（2 d）GDH活性对再生水RW1和RW2的响应不同，中长期（9~15 d）GDH活性对再生水RW1和RW2的响应同步，具体表现为第9天GDH活性同步低于对照组被抑制，第15天GDH活性同步上调高于对照组被诱导。
谷胱甘肽还原酶（GR）是能量代谢的标志物，也是植物体内一种重要的抗氧化酶类，调控植物的抗逆性或影响植物的生长发育。多种逆境条件如盐度、重金属、温度等均能诱导GR活性发生不同的变化，且GR活性的变化随物种、品种、逆境条件的不同而不同[37]。如图5（c）所示，再生水对矮牵牛GR活性具有极显著的影响（P<0.001）。再生水RW1灌溉下矮牵牛GR活性被抑制（均低于对照组），这也与其他抗氧化标志物对再生水RW1的响应趋势一致。再生水RW2灌溉的第2、15天，矮牵牛GR活性显著低于对照组，第9天GR活性与对照组相比显著升高。总的来说，再生水灌溉的矮牵牛GR活性以被抑制为主，这可能与2种再生水都含有高盐分和某些重金属有关。
糖酵解是生物体碳代谢的中心途径，丙酮酸激酶（PK）和三磷酸甘油酸激酶（PGK）是糖酵解的关键酶，可参与调控植物生长发育、抗逆响应等[38-39]。再生水灌溉下矮牵牛的PK活性变化结果〔图5（d）〕显示，再生水RW1灌溉初期（第2天）PK活性被极显著抑制（P<0.001），随着灌溉时间的延长，中期（第9天）逐步恢复至对照组同等水平，无显著性差异（P>0.05），后期（第15天）PK活性上调（高于对照组），呈极显著诱导效应（P<0.001）。再生水RW2灌溉下PK活性始终高于对照组，呈极显著诱导效应（P<0.001）。再生水RW2对矮牵牛PK活性的影响大于再生水RW1，且以诱导作用为主。再生水灌溉下矮牵牛的PGK活性变化结果〔图5（e）〕表明，再生水RW1灌溉下PGK活性始终高于对照组，被极显著诱导（P<0.001）。再生水RW2灌溉初期（第2天）PGK活性被极显著抑制（P<0.001），随着灌溉时间的延长，中期（第9天）PGK活性上调至高于对照组，由极显著抑制效应转变为诱导效应（P<0.001），后期（第15天）PGK活性降低至对照组同等水平，无显著性差异（P>0.05）。再生水RW1对矮牵牛PGK活性的影响大于再生水RW2，且以诱导作用为主。
与抗氧化酶一样，生物各种能量代谢酶对相同逆境条件所造成的胁迫也表现出显著不同的敏感性。2种再生水灌溉对矮牵牛的能量代谢标志物的影响表现为：短期内（2 d）ATPase活性被同步诱导、GR活性被同步抑制；长期（15 d ）PK、GDH活性被同步诱导，ATPase、GR活性被同步抑制。
2.6 矮牵牛生物标志物相关性分析
2种再生水灌溉下，矮牵牛的11种生物标志物的Spearman相关性分析结果如表2所示。矮牵牛的生物标志物之间存在复杂的相关关系，多种生物标志物之间的正相关关系更显著。在对照组未表现出显著的相关性，而在试验组（RW1和RW2）都表现出显著的正相关关系的生物标志物组合是T-AOC与GDH、GSH-PX与GDH、MDA与GDH、PGK与GR。SOD与GDH之间的相关性在对照组是负相关显著，在试验组（RW1和RW2）表现出显著正相关性。在对照组ATPase、GR与Chl，GR与SOD表现出显著的正相关，但在试验组（RW1和RW2）其相关性则不显著。
表 2 矮牵牛生物标志物Spearman相关性分析Table 2. Spearman correlation analysis of biomarkers in petunia hybrida生物标志物 SOD CAT GSH-PX MDA PGK ATPase PK GR GDH Chl T-AOC RW1 0.724** 0.823** 0.785** 0.976*** 0.851*** 0.769** 0.909*** 0.845*** 0.783** 0.109 RW2 0.603* 0.964*** 0.704* 0.793** 0.103 0.672* 0.984*** 0.215 0.874*** 0.191 TW 0.605* 0.782** 0.949*** 0.909*** 0.512 0.810** 0.782** 0.941*** 0.151 0.461 SOD RW1 0.204 0.304 0.815** 0.398 0.865*** 0.630* 0.250 0.590* 0.388 RW2 0.598* 0.641* 0.859*** −0.168 0.712** 0.464 −0.342 0.888*** −0.654* TW 0.039 0.326 0.776** −0.23 0.662* 0.008 0.794** −0.614* 0.072 CAT RW1 0.858*** 0.712** 0.875*** 0.378 0.767** 0.994*** 0.619* −0.173 RW2 0.857*** 0.873*** 0.344 0.821** 0.927*** 0.400 0.805** 0.136 TW 0.914*** 0.647* 0.931*** 0.356 0.995*** 0.633* 0.731** 0.257 GSH-PX RW1 0.778** 0.992*** 0.226 0.931*** 0.814** 0.903*** 0.342 RW2 0.934*** 0.618* 0.990*** 0.605* 0.499 0.626* −0.204 TW 0.777** 0.733** 0.703* 0.925*** 0.808** 0.419 0.515 MDA RW1 0.843*** 0.758** 0.942*** 0.727** 0.863*** 0.039 RW2 0.300 0.954*** 0.679* 0.179 0.846*** −0.354 TW 0.341 0.641* 0.611* 0.990*** 0.013 0.097 PGK RW1 0.333 0.959*** 0.843*** 0.915*** 0.320 RW2 0.554 0.084 0.931*** −0.202 0.190 TW 0.063 0.934*** 0.315 0.924*** 0.166 ATPase RW1 0.507 0.452 0.359 −0.078 RW2 0.559 0.404 0.654* −0.315 TW 0.392 0.739** −0.304 0.765** PK RW1 0.748** 0.967*** 0.445 RW2 0.255 0.798** 0.352 TW 0.608* 0.729** 0.334 GR RW1 0.581* −0.233 RW2 −0.212 0.527 TW −0.038 0.219 GDH RW1 0.646* RW2 −0.254 TW −0.053 综上，初步筛选出矮牵牛显著正相关的生物标志物候选组合：1）T-AOC与GDH、PK、MDA、CAT；2）SOD、ATPase、MDA；3）CAT、PK、MDA、GSH-PX；4）PGK与GR。
2.7 基于矮牵牛IBRv2的再生水环境风险评价
IBRv2法是一种基于多种生物标志物反应的生态环境健康状况综合评价的方法[40]。尽管不同的生物标志物对再生水灌溉的响应存在一定的差异，但利用IBRv2可以评价再生水灌溉对矮牵牛的整体压力影响，同时可视化反映多种生物标志物在不同再生水灌溉下的诱导和抑制效应。再生水灌溉下矮牵牛的IBRv2的分析结果〔图6（a）、（b）〕显示，2种再生水灌溉对矮牵牛的风险等级接近，但再生水RW2对矮牵牛的压力影响（IBRv2为1.31）要略高于再生水RW1（IBRv2为1.28）。2种再生水灌溉期间，矮牵牛的平均IBRv2为0.85~1.72〔图6（c）〕，环境风险水平较低。再生水RW1对矮牵牛压力影响最大的时间点为第9天（IBRv2为1.42），最小值出现在第15天（IBRv2为1.11）；再生水RW2对矮牵牛压力影响最大值在第9天（IBRv2为1.72），最小值在第2天（IBRv2为0.85）。再生水灌溉对矮牵牛的11种生物标志物都有相应的影响〔图6（d）〕，生物标志物对再生水RW1的敏感程度依次为Chl、PGK、T-AOC、ATPase、GSH-PX、CAT、GDH、MDA、GR、SOD和PK，生物标志物对再生水RW2敏感程度依为Chl、PK、GDH、GR、MDA、ATPase、CAT、SOD、GSH-PX、PGK和T-AOC。
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图 6 基于矮牵牛IBRv2的环境风险评估Figure 6. Environmental risk assessment based on IBRv2 of petunia hybrida再生水（RW1和RW2）灌溉矮牵牛的初期（第2天）ATPase和CAT被同步诱导，GR被同步抑制；中期（第9天）PGK和Chl被同步诱导，共有6种生物标志物（CAT、GDH、GSH-PX、MDA、SOD和T-AOC）被同步抑制；后期（第15天）PK和GDH被同步诱导，共有4种生物标志物（ATPase、GR、GSH-PX和MDA）被同步抑制。
生物标志物对环境因子的响应通常比个体和种群水平更灵敏，因此具有环境风险早期预警和诊断功能。虽然芯片行业再生水灌溉期间矮牵牛的平均IBRv2显示环境风险水平较低，但因芯片行业再生水含有高浓度的氯离子和TDS，仍具有一定的潜在环境风险。可通过矮牵牛生物标志物对风险因子的响应特征分析，筛选出用于再生水灌溉环境风险监测的最佳生物标志物及最佳监测时间，建立再生水灌溉的监测方案，提高回用过程中环境风险管控水平。根据矮牵牛综合生物标志物的IBRv2对2种再生水响应的一致性及生物标志物之间的显著正相关性，确定出2组最佳生物标志物组合：1）GDH、PK、MDA；2）SOD、MDA。最佳响应时间为48 h，此区间2种再生水的环境风险为RW1>RW2。
3. 结论
（1）芯片行业再生水灌溉对观赏花卉矮牵牛的生长形态无明显影响。芯片行业再生水具有高盐的特性，矮牵牛对其具有一定的耐受性，在灌溉中期（9 d）矮牵牛总蛋白、叶绿素均被显著诱导，随着灌溉时间的延长，诱导作用减弱，抑制作用开始显现。
（2）芯片行业再生水灌溉能引起矮牵牛的氧化应激，中长期（9~15 d）灌溉下矮牵牛的抗氧化标志物以抑制效应为主，但机体未出现明显的氧化损伤。矮牵牛各种能量代谢标志物的响应规律无明显的一致性，再生水长期（15 d）灌溉下PK、GDH活性被同步诱导，ATPase、GR活性被同步抑制。
（3）芯片行业再生水灌溉矮牵牛的IBRv2平均值为0.85~1.72，环境风险水平较低，但由于芯片行业再生水仍含有高浓度的氯离子和TDS，回用于绿化灌溉时需选择敏感的生物标志物对环境风险进行监测和管控。矮牵牛可用于监测预警的最佳生物标志物组合为GDH、PK、MDA或SOD、MDA，最佳响应时间为48 h。后续应进一步研发芯片行业废水降氯除盐技术，降低芯片行业再生水绿化灌溉的生态环境风险，提高芯片行业废水资源化利用水平。
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图 1 灌溉20 d后矮牵牛的生长形态
Figure 1. Growth and morphology of petunia hybrida after 20 days of irrigation
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图 2 再生水灌溉对矮牵牛总蛋白含量的影响
注: *表示差异显著水平为P<0.05, **表示差异显著水平为P<0.01，***表示差异显著水平为P<0.001。全文同。
Figure 2. Effects of reclaimed water irrigation on the total protein content of petunia hybrida
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图 3 再生水灌溉对矮牵牛叶绿素的影响
Figure 3. Effects of reclaimed water irrigation on chlorophyll of petunia hybrida
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图 5 矮牵牛能量代谢生物标志物的响应
Figure 5. Response of energy metabolism biomarkers in petunia hybrida
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图 6 基于矮牵牛IBRv2的环境风险评估
Figure 6. Environmental risk assessment based on IBRv2 of petunia hybrida
表 1 再生水的主要风险因子
Table 1 Major risk factors of reclaimed water
mg/L 编号 溶解性总固体
（TDS）浓度氯离子浓度 RW1 6680 2 041 RW2 5920 3 051 GB/T 25499—2010限值 ≤1 000 ≤250 
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表 2 矮牵牛生物标志物Spearman相关性分析
Table 2 Spearman correlation analysis of biomarkers in petunia hybrida
生物标志物 SOD CAT GSH-PX MDA PGK ATPase PK GR GDH Chl T-AOC RW1 0.724** 0.823** 0.785** 0.976*** 0.851*** 0.769** 0.909*** 0.845*** 0.783** 0.109 RW2 0.603* 0.964*** 0.704* 0.793** 0.103 0.672* 0.984*** 0.215 0.874*** 0.191 TW 0.605* 0.782** 0.949*** 0.909*** 0.512 0.810** 0.782** 0.941*** 0.151 0.461 SOD RW1 0.204 0.304 0.815** 0.398 0.865*** 0.630* 0.250 0.590* 0.388 RW2 0.598* 0.641* 0.859*** −0.168 0.712** 0.464 −0.342 0.888*** −0.654* TW 0.039 0.326 0.776** −0.23 0.662* 0.008 0.794** −0.614* 0.072 CAT RW1 0.858*** 0.712** 0.875*** 0.378 0.767** 0.994*** 0.619* −0.173 RW2 0.857*** 0.873*** 0.344 0.821** 0.927*** 0.400 0.805** 0.136 TW 0.914*** 0.647* 0.931*** 0.356 0.995*** 0.633* 0.731** 0.257 GSH-PX RW1 0.778** 0.992*** 0.226 0.931*** 0.814** 0.903*** 0.342 RW2 0.934*** 0.618* 0.990*** 0.605* 0.499 0.626* −0.204 TW 0.777** 0.733** 0.703* 0.925*** 0.808** 0.419 0.515 MDA RW1 0.843*** 0.758** 0.942*** 0.727** 0.863*** 0.039 RW2 0.300 0.954*** 0.679* 0.179 0.846*** −0.354 TW 0.341 0.641* 0.611* 0.990*** 0.013 0.097 PGK RW1 0.333 0.959*** 0.843*** 0.915*** 0.320 RW2 0.554 0.084 0.931*** −0.202 0.190 TW 0.063 0.934*** 0.315 0.924*** 0.166 ATPase RW1 0.507 0.452 0.359 −0.078 RW2 0.559 0.404 0.654* −0.315 TW 0.392 0.739** −0.304 0.765** PK RW1 0.748** 0.967*** 0.445 RW2 0.255 0.798** 0.352 TW 0.608* 0.729** 0.334 GR RW1 0.581* −0.233 RW2 −0.212 0.527 TW −0.038 0.219 GDH RW1 0.646* RW2 −0.254 TW −0.053
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